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              微生物實驗用菌種的保存方法

              瀏覽次數:389發布日期:2021-11-27

                                                                        微生物實驗用菌種的保存方法

                                                                      圣賓儀器科技(上海)有限公司

              微生物實驗用菌種是進行新產品研發和生產質量控制的標準物質。為了保證微生物實驗的準確靈敏和人員及環境的衛生安全,特制定以下規定:

                1. 菌種采集。實驗室用菌種一是到國家法定機構采購,二是購買ATCC菌種,三是科研中菌種交流。不管是哪種來源,均由公司統一采集。采集中嚴格按照規范執行。要求包裝可靠,采集迅速,不泄漏不污染。保證菌種合格和環境安全。采集中要有菌種傳代標識。

                2.菌種的活化:購買的標準菌種必須要求是凍干粉,科研中菌種交流可以為斜面或液體。

                菌種的活化最好是在非選擇性瓊脂培養基上,除非特殊情況或特別推薦,一般不用液體培養基。具體使用培養基的情況如下表,詳細菌種使用方法見附表:

                 方法:①胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA),非選擇性羊血瓊脂,PCA或營養瓊脂,35℃正常環境培養24-48小時。②非選擇性羊血瓊脂,35℃正常環境培養24-48小時。③巧克力瓊脂平板,35℃5-10%CO2環境培養24-48小時。④ CDC厭氧血瓊脂35℃厭氧培養48-72小時;部分專性厭氧菌能需要5-7天,才能充分生長;對于梭菌,以下新鮮培養基也可選用:營養瓊脂,TSA瓊脂,PCA瓊脂,需培養48-96小時。⑤沙堡氏葡萄糖Emmons瓊脂25-28℃培養3-7天;也可用PDA瓊脂。⑥巧克力瓊脂平板,35℃微需氧環境培養48-72小時。⑦ 改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂,35℃5-10%CO2或正常環境培養7天。⑧ 緩沖活性碳酵母提取物瓊脂,35℃正常環境培養3-5天。⑨巧克力瓊脂平板,35℃5-10%CO2環境培養48小時。⑩ 先用腦心浸出液肉湯或TSB培養基35℃增菌培養18-24小時,再劃線至TSA瓊脂35℃正常環境培養24-48小時。11、先接種于MRS肉湯35℃增菌培養24-48小時,再劃線接種至含羊血的哥倫比亞CNA培養基35℃5%CO2環境培養24-48小時。12、 PDA瓊脂45℃正常環境培養48-72小時。13、 先接種于10B精氨酸肉湯,作系列梯度稀釋35℃正常培養至培養基變成粉紅色,接入A-8瓊脂。

                3.菌種保存。所有菌種均由實驗室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺帳,詳細記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況;每一種菌種一定要有本公司的檢測鑒定報告(具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法);具體菌種保存方法如下:

                3.1 干粉菌種:購買的干粉菌種保存于2-8℃冰箱中,可保存3-5年。

                3.2 斜面菌種或液體菌種:

                3.2.1 液氮罐保存方法:用于第一代菌種的長期保存,每種菌種保存5管。

               ?。?)準備用于液氮保藏的安瓿管或菌種保存管(塑料),要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1.2mm液體的。

               ?。?)加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時,則將空安瓿管塞上棉塞, 121℃滅菌15分鐘:若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液,加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限,而后再用121℃滅菌15分鐘。

               ?。?)接入菌種:將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液,裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器,從平板內切取菌落圓塊,放入含有保護劑的安瓿管內,然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

               ?。?)凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍,則在細胞內會形成冰的結晶,因而降低存活率。

               ?。?)保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內,然后再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃,液態氮內為-196℃。

               ?。?)恢復培養保藏的菌種需要用時,將安瓿管取出,立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍,直到全部融化為止。再打開安瓿管,將內容物移入適宜的培養基上培養。

                此法除適宜于一般微生物的保藏外,對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏,而且性狀不變異。

               3.2.2 液體石蠟保存法:將液體石蠟分裝于三角燒瓶內,塞上棉塞,并用牛皮紙包扎, 121℃滅菌30分鐘,然后放在40℃溫箱中,使水汽蒸發掉,備用。將需要保藏的菌種,在最適宜的斜面培養基中培養,使得到健壯的菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1cm為準,使菌種與空氣隔絕。將試管直立,置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長)。

                大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌(禽霍亂)、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產氣腸桿菌、志賀氏菌屬;接種于半固體培養基上,36±1℃培養18-24小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。注:副溶血性弧菌接種于含鹽的半固體培養基上,36±1℃培養18-24小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于室溫

                產氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌:接種于CDC厭氧菌瓊脂中,培養18-24小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。酵母菌:接種于YPD培養基中,28℃培養24-48小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。霉菌、白色念珠球菌:接種于PDA培養基中,28℃培養24-48小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。鏈球菌屬:接種于羊血瓊脂,36±1℃培養24-48小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂,36±1℃培養24-48小時,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。分枝桿菌屬:接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養7天,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。

                4.菌種制備。菌種制備按照批準的制備計劃執行。制備中要按規范要求操作,同時做好工作記錄。記錄內容包括:菌種名稱,傳代標識、制備數量。在制備容器上作出明確表示。具體菌種制備方法如下:可以麥氏比濁管計數每ml菌液的菌數

                1)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌(禽霍亂)、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產氣腸桿菌、志賀氏菌屬;把各種細菌菌種劃線接種于營養瓊脂平板上,36±1℃培養18-24小時,挑取單菌落接種于10ml營養肉湯中,36±1℃培養18-24小時,計數出每ml營養肉湯中的細菌數。把菌液保存于2-8℃,此菌液可保存7-10天,每10天重新挑取單菌落接種于10ml營養肉湯中, 36±1℃培養18-24小時,用生理鹽水稀釋到10-7,計數出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml營養肉湯中的細菌數。

                2)產氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌等厭氧菌直接接種于10ml液體硫乙醇酸鹽培養基中,36±1℃培養18-24小時,計數出每ml液體硫乙醇酸鹽培養基中的細菌數(在厭氧條件下培養)。

                3)酵母菌、霉菌和白色念珠球菌:接種于PDA培養基中,28℃培養24-48小時,挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養基中,28℃培養24-48小時,用YPD瓊脂計數出每ml葡萄糖蛋白胨培養基中的菌落。把菌液保存于2-8℃,此菌液可保存7-10天,每10天重新挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養基中,28℃培養24-48小時,用生理鹽水稀釋到10-7,計數出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml葡萄糖蛋白胨培養基中的菌數。

                4)鏈球菌屬:接種于腦心浸液中36±1℃培養18-24小時,計數出每ml腦心浸液中的細菌數。把菌液保存于2-8℃,此菌液可保存7-10天,每10天重新挑取單菌落接種于10ml腦心浸液中, 36±1℃培養18-24小時,用生理鹽水稀釋到10-7,計數出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml腦心浸液中的細菌數。

                5)副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂,36±1℃培養18-24小時,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋,經比濁后制成每1ml含菌數約相當于100~1000cfu的菌懸液。

                6) 分枝桿菌屬:接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養7天,用0.9%無菌氯化鈉溶液將上述增菌培養后的質控菌種的新鮮培養物制成1.0~3.0×103CFU/ml的菌懸液,作為工作菌液。

                5.菌種的標識和使用期限:標識:菌種代數的計算為干粉菌種為第0代,轉接一次斜面加一代。具體標識為:例單增李斯特氏菌ATCC19114第0代,表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-0,第一代表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-1;第一代有12支,則表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-1-1、……、單增李斯特氏菌ATCC19114-1-12;使用期限:傳代次數不得超過5代,菌種已變異或生化鑒定不符合;

                6.菌種使用。菌種管理員,每月領取1支第一代(或第二代、第三代)菌種。再根據以上方法制備工作菌液,分發給實際使用者,實際使用者領用前應充分考慮重復實驗的需要。同一實驗要選擇同代菌種,保證實驗的可比性。領用菌種要詳細登記,領用人要簽字,并注明領用時間。

                7.菌種處理。實驗完畢的菌種遺留物和污染物應嚴格按照三廢處理規定執行。提供給外部的菌種必須經公司總經理批準,按規定要求包裝運輸。嚴禁私自對外提供菌種。

                                                                                                                                                        本篇轉載至實驗之家

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